?摘要

    Teledyne ISCO 分析色譜柱在ACCQPrep®  HPLC 系統(tǒng)通過一次簡單的Z查運行即可生成分離方法。該流程不僅能匹配RediSep® HPLC色譜柱，也匹配RediSep Gold®金標快速色譜柱，這意味著用戶可以同時開發(fā)閃式快速色譜的方法。來自其他供應商的C18色譜柱也可以用于方法開發(fā)，但與RediSep色譜柱相比，選擇性可能稍微存在差異，這意味著出峰時間可能不一定會在預期的時間被洗脫。在本應用報告中描述的方法放大流程是有效的，只需將時間轉換成柱體積，因為一個化合物在某個特定溶劑組份的洗脫時間是特定的。另一種方法是使用ACCQPrep HP150使用RediSep Prep色譜柱和內置在系統(tǒng)中的聚焦梯度發(fā)生器，從偵測運行中快速創(chuàng)建聚焦梯度(參考應用報告AN119)。

實驗儀器和色譜柱

    分析HPLC系統(tǒng)和表1中列出的色譜柱。

    如果需要溶劑改良劑，同樣的改良劑需同時應用于高效液相色譜儀和閃式快速制備系統(tǒng)，揮發(fā)性改進劑在純化后更容易從樣品中去除。

實驗結果和討論

    對于閃式快速色譜，Shou選洗脫時間約6個柱體積(CV)，當轉換為CV單位時，很容易將uHPLC梯度從一個色譜柱放大到另一個色譜柱。

    三段線性梯度效果很好，第一段為12 個CV，目標化合物洗脫在中間，約6個 CV，不管怎樣，起始和結束溶劑組成是洗脫化合物所需要的。由于HPLC系統(tǒng)駐留死體積的原因，沒有必要在運行開始時等度保持，相對于柱體積和HPLC駐留死體積的大小，運行CombiFlash®NextGen梯度時，目標化合物可能提前或稍微滯后被洗脫。添加一個0.01分鐘時長的步驟，然后以100% B清洗色譜柱中清除殘留化合物。

    每段長度(以分鐘為單位)的計算方法是用梯度長度乘以柱體積，然后除以流速。梯度表是通過將分段長度加到前幾次的總和而得到的。在表2中，柱體積中的片段長度被轉換為時間，并將添加的片段長度形成梯度表。

    如果方法的分離度可以接受，使用相同的梯度表很容易創(chuàng)建一個閃式快速的梯度，用于以CV為單位的CombiFlash儀器。

結果

    下面顯示的運行使用了表2中列出的梯度片段。一次運行使用2 × 50mm C8色譜柱，另一次使用4.6 × 150mm C18色譜柱。Benzophenone在水/乙腈體系的梯度洗脫。

C8, 2x50 mm 運行實例

    在RediSep Prep C8 2 x 50 mm色譜柱上開發(fā)的方法，3分鐘內，梯度為40% - 50% B，然后一步升到100% B，使用水/乙腈體系清除色譜柱中的雜質。

    化合物洗脫時間為2min或7.9 CV。然后樣品在50 g RediSep Rf Gold C8柱(PN 69-2203-712)上運行，使用相同的梯度，和已確定的柱體積。

    閃式快速色譜柱的洗脫與uHPLC柱的洗脫非常接近，表明該方法可以通過這種方式轉移。

C18, 4.6 x 150 mm 運行實例

    在4.6 × 510mm RediSep Prep C18色譜柱上建立了的方法

    使用水/乙腈體系，在18分鐘內，梯度為50% - 60% B，然后一步升到100% B，以從色譜柱中清洗污染物。C18比C8具有更強的保留能力，因此在柱體積相同的保留時間下，需要更強的溶劑體系才能得到洗脫。

    該化合物在11.9min或7.9 CV洗脫。將方法轉移到50 g RediSep Rf Gold C18色譜柱(PN 69-2203-336)上運行，水/乙腈體系中。

    再一次表明，閃式快速色譜柱與分析用高效液相色譜保留有很好的一致性。

    值得注意的是，從uHPLC色譜柱轉換的方法在閃式快速色譜柱洗脫比預測保留時間稍早，而HPLC預測的洗脫時間比實際閃式快速色譜柱洗脫時間稍早。這是因為在計算中沒有考慮系統(tǒng)駐留死體積。

    uHPLC和HPLC色譜柱在同一分析儀器上運行，分析系統(tǒng)駐留死體積相對于uHPLC柱更大，但相對于4.6 mm色譜柱較小，因此不同運行時間梯度延遲的程度不同。在分析過程中，好使目標化合物的洗脫在梯度的中間，以允許不同儀器之間保留體積一定的變化。 

結論

    RediSep Prep色譜柱可以可靠地用于開發(fā)閃式快速色譜的方法，2 × 50mm uHPLC色譜柱是非?？焖俚姆椒ㄩ_發(fā)手段，運行基本在5分鐘內完成。兩種色譜柱都需要極少量的樣品，節(jié)省幾乎所有的待純化樣品。
 

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